什么是标记定量蛋白质组学？

标记定量蛋白质组学是一种采用化学或同位素标签对蛋白质或肽段进行标记的技术，旨在通过质谱分析区分不同样本，从而实现相对或绝对定量。常用方法包括iTRAQ、TMT和SILAC等。

SILAC与iTRAQ/TMT在蛋白质定量上的区别

SILAC主要用于细胞培养过程中的代谢标记，通常支持2-3重标记（使用NeuCode可支持4重以上），定量在一级质谱（MS1）水平进行。而iTRAQ是一种化学同位素标记方法，支持4-8重，定量在二级质谱（MS2）水平进行。TMT同样是同位素化学标记技术，支持10-18重，特别适合大规模、高通量研究，并在MS2水平进行定量。

基于标记的定量蛋白质组学的优势

与非标记方法相比，基于标记的蛋白质组学提供更高的定量准确度和样本间重现性。这是因为所有样本同时混合分析，减少了单独运行带来的技术差异，且允许多重分析，从而在一次质谱分析中比较多个样本。

如何选择合适的标记定量方法

选择标记定量方法需考虑样本类型、实验规模和研究目标：

1. 对于活细胞，需在细胞水平进行精确定量，推荐使用SILAC，适合动态研究。
2. iTRAQ则适合组织或体液样本，提供中等通量研究所需的敏感性和可重复性。
3. TMT适用于组织和体液样本，尤其适合高通量研究，支持每次最多18个样本的分析。

还需考虑仪器兼容性、所需的多重分析水平及预算等因素。

为何在iTRAQ/TMT定量中使用MS²而非MS¹？

在iTRAQ和TMT实验中，所有标记肽段在MS¹水平上共流出，无法分辨。只有在MS²碎裂后，各标记肽段释放出不同m/z的报告离子，借此可以根据这些报告离子的强度进行精确的定量。

标记定量可否用于绝对定量？

是的，基于标记的定量蛋白质组学可以实现绝对定量，但需使用已知浓度的标准肽段或蛋白质进行校准。通过加入已知浓度的合成肽段，生成标准曲线，对样品中的目标蛋白进行绝对浓度计算。这种方法通常比相对定量更为复杂，适用于对蛋白质含量有精确定量要求的情况。

可在同一批TMT或iTRAQ实验中混合的样本

建议将来源一致、处理条件明确且具有可比性的样本放在同一TMT或iTRAQ批次中，例如同种细胞或组织在“对照vs药物处理”条件下的比较。混合不同组织样本可能会导致高丰度蛋白掩盖低丰度信号，降低定量准确性。此外，需避免将不同批次处理的样本混入同一标记组，以减少技术误差干扰。

TMT信号偏移的处理

部分信号偏差可以通过总强度归一化和中位数校正等技术层面调整，但若生物背景差异过大，归一化可能掩盖真实差异或放大假阳性。因此，数据预处理不能替代科学的实验分组。

在SILAC标记后多长时间提取细胞蛋白？

SILAC是一种体内标记技术，通常需连续传代5-6代以确保天然氨基酸被同位素氨基酸完全替代。具体时间因细胞类型而异。标记是否完成可通过质谱预实验检测，建议标记率达到≥95%后再进行正式分析。

如何评估TMT实验中样本混合的均一性

可在标记前后对样本进行SDS-PAGE定量比对，标记后也可在质谱中查看报告离子强度是否均匀。如偏差显著，应考虑重新标记或混合。

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